Traitement à l'eau chaude de matériel fruitier infecté par des virus, bactéries ou phytoplasmes

Résultats du projet ThermoFruit

Traitement à l'eau chaude de matériel fruitier infecté par des virus, bactéries ou phytoplasmes
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Est-il possible d'éliminer efficacement des agents pathogènes de type virus, phytoplasmes ou bactéries endophytes par traitement à l'eau chaude ? Quel est l'impact de cette technique sur les tissus végétaux et leur multiplication ? Ce sont les principaux questionnements qui ont conduit à l'élaboration du projet ThermoFruit, mené entre 2019 et 2021.

Publié le 01/07/2023

Temps de lecture estimé : 21 minutes

Une preuve de concept pour plusieurs espèces et agents pathogènes

Comment multiplier et implanter sur le territoire français du matériel fruitier exempt d'agents pathogènes épidémiques ? Plusieurs problématiques d'ordre sanitaire, technique et économique, liées à la présence d'agents pathogènes émergents ou ré-émergents, aux évolutions réglementaires et aux objectifs de sécurisation alimentaire impactent de nos jours la multiplication du matériel fruitier. En conséquence, les filières professionnelles, les pépiniéristes et les gestionnaires de ressources génétiques recherchent de nouvelles méthodes de protection contre les bioagresseurs qui affectent la qualité sanitaire du matériel végétal afin de proposer non pas une mais plusieurs stratégies complémentaires.

En 2018, le CTIFL, INRAE et le syndicat des pépiniéristes fruitiers CEP ont construit un projet autour de la technique du traitement à l'eau chaude (TEC). Ce projet, nommé « ThermoFruit » (CasDAR n°C-2018-12 – Semences et sélection végétale, volet Appui Méthodologique aux Sections), a été présenté dans l'article Traitement à l'eau chaude pour l'assainissement du matériel fruitier – Le projet ThermoFruit évalue la faisabilité, Infos-CTIFL N° 357, décembre 2019. Ce projet a été réalisé entre janvier 2019 et décembre 2021. Il est construit sous la forme d'une « preuve de concept » afin d'évaluer l'impact du traitement à l'eau chaude sur plusieurs espèces fruitières et pour différents agents pathogènes. Le protocole expérimental du traitement à l'eau chaude par trempage est élaboré à partir des références bibliographiques sur d'autres espèces végétales comme reporté dans l'article de 2019 [1]. Le protocole utilisé est synthétisé dans l'encadré Le protocole mis en oeuvre en laboratoire et serre. Les expérimentations ont été mises en oeuvre de manière collective par le CTIFL (porteur du projet) et quatre Centres de Ressources Biologiques INRAE (CRB Citrus à San Giuliano, CRB Prunus à Avignon et Bourran et CRB Fruits à pépins à Angers).

Évaluer l'impact de la chaleur sur le matériel végétal fruitier

La première partie du projet a consisté à évaluer l'impact de la chaleur sur les tissus végétaux sains c'est-à-dire non infectés par un agent pathogène. Si l'objectif du traitement par trempage dans l'eau chaude est d'éliminer des bactéries, phytoplasmes ou virus, cette technique doit également permettre la survie du matériel fruitier qui pourra ensuite être multiplié par bouturage ou greffage.

Pour le choix des espèces fruitières à évaluer, des espèces représentatives des filières nationales ont été retenues : pommier, poirier, prunier domestique et américano-­japonais, cerisier, abricotier et les espèces d'agrumes de type mandarinier, oranger, citronnier, pomelo et cédratier. Au total, 28 cultivars ont été testés, avec une répartition de deux à cinq cultivars par espèce.

Afin d'évaluer l'innocuité de cette technique sur le matériel végétal avant greffage (rameaux), l'ensemble des partenaires a préétabli, lors des comités de pilotage, différents couples de température-durée à expérimenter. Peu de travaux sont référencés dans la littérature sur le traitement à l'eau chaude et les couples sont déterminées sur la base d'expérimentations précédentes pour les arbres fruitiers, celles mises en place sur la vigne [2] et les expertises propres aux partenaires CTIFL et INRAE. Pour chaque cultivar fruitier à tester, entre 7 et 23 couples sont retenus, avec des plages de températures allant de 40 °C à 60 °C. L'ensemble des résultats est accessible dans l'encadré Taux de reprise au greffage de différentes espèces fruitières après trempage à l'eau chaude.

Les arbres fruitiers à noyau : abricotier, cerisier, prunier domestique et américano-japonais

Pour les abricotiers Prunus armeniaca, quel que soit le temps de trempage, aucun des bourgeons traités à une température de 50 °C n'a repoussé après greffage. Les rameaux traités à la température de 50 °C présentaient effectivement des brunissements et des nécroses des tissus visibles sous écorce ou lors du prélèvement des yeux. À 45 °C, l'impact du traitement est moins important mais le taux de reprise est assez faible, inférieur à 50 % de plants greffés repris sur les dix greffes réalisées par variété après traitement. De plus, les comportements observés sont différents entre les cinq variétés testées, avec une sensibilité plus forte constatée pour Orangered® Bhart(cov) et Rouge du Roussillon par rapport à Bergeron, Carmingo® Farbaly(cov) et Goldrich.

Pour les variétés de pruniers américano-­japonais Prunus salicina et domestique Prunus domestica, les résultats sont similaires à l'abricotier : aucune reprise après traitement puis greffage pour les cultivars traités à 50 °C. Pour les cultivars Prune d'Ente, Golden Japan et Soryana, quelques yeux ont repris pour différentes durées de trempages à 50 °C ou 55 °C. Des essais complémentaires visant à allonger les durées de trempage, reportées dans les colonnes bleues du tableau dans l'encadré Taux de reprise au greffage de différentes espèces fruitières après trempage à l'eau chaude, ont montré une tolérance au traitement à 45 °C sur des durées plus longues de 60, 70 et 90 min.

Pour le cerisier Prunus avium, les expérimentations sont seulement réalisées sur deux variétés. Ces deux variétés semblent avoir les mêmes niveaux de sensibilité, avec une mortalité de tous les bourgeons sur les deux cultivars testés après trempage à 50 °C et 55 °C, alors que les cultivars testés à 40 °C et 45 °C montrent globalement de bons taux de reprise.

En synthèse pour les espèces d'arbres fruitiers à noyau, les résultats montrent une survie des cultivars pour les plages de températures allant de 40 °C à 45 °C mais les taux de reprise sont très hétérogènes et systématiquement sous les 60 % pour les pruniers domestique ou américano-­japonais et l'abricotier. Les températures de 50 °C et 55 °C sont critiques pour ces espèces et ne permettent pas, sauf rares exceptions, la survie des rameaux et des yeux. Le faible nombre de répétitions et de cultivars évalués ne permet pas de préciser clairement les seuils.

Pommier et poirier

Pour les espèces Malus domestica et Pyrus communis, les références dans la bibliographie sur la sensibilité à la chaleur et l'expertise du partenaire INRAE ont permis de cibler les couples température-durée à expérimenter, en se focalisant principalement sur une température de 45 °C. Cette température permet d'obtenir un taux de reprise semblable à celui du témoin. De manière similaire à ce qui a été observé sur les Prunus, il apparaît également que les modalités à 55 °C et 60 °C ne permettent pas la survie des bourgeons. Les résultats des taux de réussite du greffage après traitement pour le pommier et le poirier montrent un comportement similaire entre les deux espèces.

Agrumes

Les premiers essais de trempage au bain-marie réalisés en 2019 ont montré une altération très rapide des tissus après traitement ainsi qu'un taux de survie très faible à des températures de 45 °C, voire 40 °C pour toutes les espèces de Citrus évaluées. L'espèce cédratier a notamment montré une sensibilité très forte avec pratiquement aucun plant repris après greffage, même à une température de 40 °C. Dans l'hypothèse d'une sensibilité plus élevée, un réajustement des durées de trempages à 40 °C et 45 °C a été réalisé mais les taux de reprises étaient tout aussi faibles. Ces observations semblent indiquer un effet direct de l'immersion dans le bain d'eau chaude.

Un autre dispositif expérimental a donc été élaboré, cette fois-ci avec des bains de vapeur d'eau dans l'objectif d'atteindre des températures de 40 °C et 45 °C au niveau du cultivar à traiter. Ce dispositif expérimental a été mis en place avec un bain-marie de laboratoire chauffé au-dessus duquel les rameaux sont disposés sur un support métallique (Figure 1). L'ensemble est enfermé sous un film plastique afin de maintenir la vapeur. La température de traitement est contrôlée par une sonde de température placée au niveau du matériel végétal. Avec ce nouveau dispositif, aucune altération des tissus n'a été observée après le traitement à la vapeur, quel que soit le temps de contact. Les taux de reprises au greffage ont été également grandement améliorés comparativement au trempage dans l'eau chaude, comme reporté dans le tableau de la figure 1. Au contraire du trempage, le cédratier n'a pas montré de sensibilité particulière pour la quasi-totalité des couples testés.

Figure 1 : Taux de reprise au greffage de différentes espèces fruitières après trempage à l'eau chaude

Différents niveaux de tolérance selon l'espèce

Les travaux réalisés ont permis d'obtenir des informations sur l'impact du traitement pour les différentes espèces végétales testées. En dehors de l'effet « expérimentateur » et des difficultés techniques observées au greffage notamment, la sensibilité à la chaleur du matériel végétal fruitier (rameaux, boutures, plants) semble conditionnée par différents facteurs : l'espèce botanique, le calibre du matériel végétal traité et le type de matériel végétal.

Selon les espèces, les essais réalisés permettent de définir la température de 45 °C comme étant la plus appropriée car assurant la survie du matériel. Le trempage de rameaux d'arbres fruitiers à une température supérieure à 50 °C pendant 15 min entraîne des lésions directes des tissus et/ou l'absence de reprise des yeux greffés quel que soit le genre végétal, Prunus, Malus, Pyrus ou Citrus. En dehors des cultivars de pommier et de poirier testés, le taux de survie observé à 45 °C n'est pas élevé avec généralement moins de 60 % de reprises après traitement. Ces données devraient être complétées par d'autres expérimentations avec plus de répétitions, 50 à 100 plants par couple testé, et en étendant l'ensemble des couples à toutes les espèces. En effet, seules les espèces de prunier domestique et américano-­japonais, de pommier et de poirier ont pu être testées pour des durées longues de trempage à 45 °C. Les taux de reprises observés seront également à améliorer afin de s'approcher des taux observés en conditions de multiplication commerciale. Les contraintes techniques liées aux conditions expérimentales choisies et aux mauvaises reprises n'ont pas permis d'obtenir des résultats complets pour l'abricotier et le cerisier. L'utilisation de la technique de désinfection à air chaud (vapeur) semble intéressante pour les espèces sensibles, comme cela a été observé et expérimenté pour les agrumes. Cette technique permet de placer le matériel à traiter en conditions de températures similaires tout en diminuant l'impact sur les tissus dû à l'immersion dans l'eau. En effet, les résultats obtenus pour les agrumes montrent une bonne tolérance du matériel à des températures de 45 °C, 50 °C ou même 55 °C qui se sont avérées trop impactantes lors de l'immersion directe dans l'eau chaude.

Efficacité du traitement sur différents couples hôtes-agents pathogènes

Plum pox virus

Concernant le virus de la Sharka, les essais ont concerné dans un premier temps le couple Plum pox virus PPV-abricotier en collectant des rameaux d'arbres infectés. Plus de vingt couples ont été testés en prenant en compte les résultats obtenus sur matériel végétal avec des trempages réalisés de 40 °C à 55 °C pendant 15 à 180 min. Contrairement à ce qui a pu être observé lors de la phase d'évaluation de l'impact de la chaleur sur le matériel végétal fruitier pour les températures inférieures à 55 °C, la majorité des greffes réalisées ont repris après quatre mois : 66 greffes sur 70. Les repousses ont permis de confirmer ou d'infirmer la présence du virus en observant l'apparition de symptômes sur les feuilles d'abricotier et sur le porte-greffe pêcher sensible et par tests sérologiques spécifiques du PPV. Les résultats présentés dans la figure 2 montrent qu'à partir de 40 °C et jusqu'au couple 45 °C – 60 min, il n'y a pas de destruction totale du virus quelle que soit la durée d'exposition des rameaux au traitement. Ces couples de traitement n'ont donc pas altéré les tissus mais n'ont pas non plus éliminé le virus. En revanche, la durée de trempage influence l'élimination apparente du virus dès 45 °C pour les expositions longues, c'est-à-dire supérieures à 70 min et à 50 °C dès 15 min.

Figure 2 : Impact de différentes températures sur rameaux d'agrumes (durée 50 minutes)

Les essais complémentaires réalisés sur le couple PPV-prunier ont permis de préciser les plages de sensibilité du virus à la température et pour cette espèce hôte. Ces expérimentations ont été réalisées à partir de rameaux infectés du cultivar de porte-greffe prunier Myrobolan P1254 Prunus cerasifera en intégrant des durées de trempage longues, notamment à 45 °C, en appui des résultats obtenus sur abricotier. Les résultats rapportés dans la figure 3 montrent également, dans le cas du prunier, une dégradation du virus à 45 °C pour de très longues durées d'exposition (180 min), ainsi qu'à 50 °C à partir de 30 min. Ces différents résultats montrent donc la possible élimination du virus PPV de rameaux de prunier et d'abricotier avant greffage avec des couples 45 °C – 180 min ou 50 °C – 30 min ou plus long.

Phytoplasme de l'enroulement chlorotique de l'abricotier

En 2020, des lots de rameaux à greffons de prunier américano-japonais et d'abricotier sont collectés à partir d'arbres infectés par le phytoplasme associé à l'enroulement chlorotique de l'abricotier (ECA). Après confirmation de l'infection par la technique PCR [3], les lots de rameaux sont répartis selon différents trempages en s'appuyant sur les résultats de la phase d'évaluation de l'impact de la chaleur sur le matériel végétal fruitier. Deux séries de trempages sont réalisées pour le couple ECA/Prunier et deux séries pour le couple ECA/Abricotier, avec chacune 15 couples testés en incluant les témoins non traités.

Après trempages, les yeux sont greffés sur porte-greffe pêcher en serre. Les résultats des taux de reprises montrent une disparité de reprises entre le prunier et l'abricotier. En dehors d'un effet espèce, ces résultats peuvent être dus à une différence de qualité de matériel car le matériel abricotier était principalement constitué de rameaux âgés d'un à deux ans, alors que le matériel prunier était constitué de rameaux de l'année. Des taux de reprise moyens sont observés pour les témoins non traités, particulièrement sur prunier. Aucune reprise n'est observée pour les couples supérieurs à 45 °C – 90 min à la fois pour le prunier et l'abricotier (Figure 4).

Figure 4 : Expérimentation de traitement à l'eau chaude contre le PPV - Pourcentage de plants d'abricotier positifs au virus de la Sharka (PPV) sur indicateur pêcher GF305 après greffage

Ces résultats sont cohérents avec les résultats obtenus par les partenaires dans le cadre de la phase d'évaluation et la sensibilité des espèces. À la suite du premier cycle de végétation, les plants sont élevés en serre pendant deux cycles supplémentaires en 2021 et en 2022. Pour chacun de ces cycles, les plants sont observés pour l'identification de symptômes puis échantillonnés individuellement pour rechercher la présence du phytoplasme de l'ECA par PCR. Le phytoplasme Candidatus Phytoplasma prunorum responsable de cette maladie se multiplie dans les vaisseaux conducteurs du phloème, il est donc nécessaire de disposer d'assez de matériel végétal pour réaliser les analyses de détection au laboratoire par la technique PCR. La réalisation de plusieurs cycles végétatifs permet également d'identifier un éventuel effet de latence de l'infection.

Les connaissances concernant les phytoplasmes, leur biologie et leur multiplication au sein de la plante doivent amener à une approche prudente des résultats obtenus sur des jeunes plants après seulement un ou deux cycles végétatifs après greffage. En effet les phytoplasmes, strictement inféodés aux vaisseaux conducteurs du phloème, ne sont pas répartis de manière homogène dans la plante. Les suivis d'infections en verger et les données scientifiques permettent d'affirmer que, lors d'une primo-infection, les populations de phytoplasmes n'atteignent un seuil important que plusieurs mois voire plusieurs années après l'infection.

Dans le cadre des essais conduits, il apparaît ainsi intéressant d'observer le comportement et les taux d'infection des plants greffés après traitement sur une période adaptée à la biologie de l'agent pathogène. La synthèse des résultats concernant les expérimentations sur prunier est reportée dans la figure 5. Les résultats obtenus au cours du second cycle n'ont mis en évidence aucun arbre positif après traitement à partir du couple 45 °C – 55 min pour les 17 arbres vivants sur les 20 greffés au total. Pour le couple précédent, 45 °C – 50 min, le taux de positivité est très faible avec seulement un arbre positif sur les 19 vivants. Pour les trois couples en dessous de 45 °C – 30 min, les arbres testés sont systématiquement positifs, ce qui montre que ces couples ne sont pas suffisants pour éliminer le phytoplasme des rameaux avant greffage. Ces résultats sont également associés à l'observation de symptômes de chlorose et enroulement sur les plants greffés pour les couples inférieurs 45 °C – 30 min. L'efficacité du traitement sur les populations de phytoplasme est également visible sur les résultats des analyses PCR, avec des variations nettes d'intensité des bandes de migration des produits PCR utilisées pour l'interprétation des résultats au laboratoire. Les observations et analyses réalisées au cours du troisième et dernier cycle végétatif ont permis de compléter les premiers résultats. L'efficacité du traitement est confirmée à 45 °C – 50 min et 55 min, toutefois quelques plants se retrouvent infectés au-delà de ces couples de traitement comme le montre la figure 5. Ceci illustre le phénomène de latence, de seuil d'infection et de détection des phytoplasmes mentionné précédemment et qui peut conduire à réviser le statut d'un arbre selon son âge et la saison. D'après les données obtenues, le traitement ayant permis d'assainir un maximum de plants pour les deux arbres traités est donc situé à 45 °C – 70 min (efficacité du traitement supérieure à 95 %) ou supérieur. Les taux de reprises sur prunier américano-­japonais constatés dans nos conditions sont bons avec 90 % de reprise sur les 20 plants greffés en serre.

Figure 5 - Expérimentation PPV - Pourcentage de plants de prunier (PR) et abricotier (AB) positifs PPV après greffage pour des modalités de traitement à l'eau chaude identiques

Concernant les abricotiers infectés par l'ECA, les mêmes expérimentations ont été réalisées et ont permis d'identifier le seuil d'élimination du phytoplasme à 45 °C – 35 min. Toutefois les résultats pour l'abricotier sont partiels et n'ont pas pu être reproduits sur les différents cycles de végétation. Au regard de ce qui a été observé sur prunier avec l'effet latence, il sera nécessaire de compléter ces essais afin d'établir une conclusion sur l'efficacité de l'élimination de l'ECA pour cette espèce.

Bactérie du Huanglongbing

Les espèces de bactéries Candidatus Liberibacter spp, associées à la maladie du « greening » des agrumes ou Huanglongbing (HLB) sont réglementées de quarantaine au sein de l'Union européenne. Cette maladie est considérée comme une des menaces principales pour les différentes productions d'agrumes du bassin méditerranéen. Elle a déjà provoqué d'énormes pertes de production au Brésil et aux États-Unis [4]. Pour les essais relatifs au projet, le matériel végétal infecté par la bactérie a été collecté dans la collection d'agrumes du Centre de Ressources Biologiques des Plantes Tropicales (CRB-PT) de la Guadeloupe gérée par le CIRAD et INRAE. Cette collection est fortement touchée par le HLB. Les expérimentations ont été réalisées par le CIRAD des Antilles-Guyane en coordination avec le partenaire INRAE de Corse.

À la suite des essais réalisés sur le matériel agrumes lors de la phase d'évaluation de l'impact de la chaleur sur le matériel végétal fruitier, le dispositif de traitement à la vapeur est mis en oeuvre afin d'éviter le contact direct avec l'eau qui dégrade le matériel végétal. Les rameaux infectés sont ainsi traités selon la méthodologie adaptée aux agrumes. Après traitement, les rameaux sont bouturés dans un substrat approprié avec ajout d'hormones de croissance afin d'optimiser leur croissance en serre. Comme pour les Prunus, les traitements sont réalisés selon les seuils de sensibilité identifiés pour ces espèces tout en visant des températures potentiellement nuisibles à la bactérie. Les résultats obtenus lors de la phase d'évaluation de l'impact de la chaleur sur le matériel végétal fruitier ont ainsi pu être reproduits avec notamment la dégradation des rameaux à 50 °C et 55 °C ainsi que la sensibilité accrue du cédratier. Les meilleurs taux de reprises sont également obtenus pour la température de 40 °C, avec une bonne reprise pour l'oranger, le citronnier et le clémentinier. Le couple « seuil » pour les agrumes est observé à 45 °C – 40 min. Au-dessus de ce couple, seules quelques boutures de clémentinier et d'oranger ont pu survivre.

En ce qui concerne la survie de la bactérie, après deux mois et demi, l'ensemble des boutures viables ont été testées par tests PCR en temps réel et se sont révélées négatives au HLB. Néanmoins après six mois, une nouvelle série d'analyses des boutures restantes les a révélées toutes positives au HLB, quelles que soient la température et la durée appliquées. Il semble donc que le travail réalisé n'ait pas permis d'assainir le matériel végétal infecté par HLB par traitement à la vapeur. La méthode utilisée semble également affecter fortement le taux de reprise et de survie des boutures.

Bactérie du feu bactérien

Comme pour les travaux réalisés sur la bactérie HLB, les expérimentations visant à déterminer l'impact du traitement à l'eau chaude sur la bactérie Erwinia amylovora, responsable du feu bactérien, ont nécessité d'adapter la méthodologie expérimentale.

En effet concernant les bactéries, du fait de l'impossibilité de diagnostiquer un arbre positif sans la présence de symptômes ou d'exsudats caractéristiques, il est nécessaire de produire suffisamment de matériel infecté pour alimenter les expérimentations. Les essais sont réalisés sur des porte-greffe de pommier du cultivar MM106 et de poirier Kirchensaller. Les plants sont infectés artificiellement par dépôt d'inoculum (bactéries Erwinia amylovora en suspension dans l'eau) sur des blessures sur l'apex des pousses et sur les feuilles apicales. Des sections de rameaux de poirier et pommier présentant des symptômes sont ensuite prélevées un mois après l'apparition des symptômes et réparties de façon aléatoire pour la réalisation du traitement.

Les couples mis en oeuvre pour les espèces poirier et pommier sont les mêmes que ceux testés dans la phase d'évaluation à l'exception des couples ayant conduit à une absence de régénération des bourgeons. Un couple de trempage dans de l'eau à température ambiante (20 °C) a été ajouté en tant que témoin de traitement à l'eau, en complément du témoin non traité. Après traitement, la détermination de la viabilité de la bactérie est réalisée pour chaque segment de rameau par la mise en culture d'un tronçon de 5 mm de long en boîte de Petri sur un milieu adapté, pendant 48 heures. Après cette phase d'enrichissement, une analyse par PCR en temps réel a permis de déterminer la présence ou non de bactéries vivantes [5]. Les résultats sont reportés dans le tableau de la figure 6.

Figure 6 : Expérimentation de traitement à l'eau chaude contre l'ECA sur prunier salicina - non reprise des yeux greffés pour les modalités ></figure> 45°C-90'

Les analyses révèlent une absence de bactéries vivantes dans les rameaux infectés pour toutes les modalités de traitement à l'eau chaude testées à 45 °C ou 50 °C. Les résultats des trempages dans l'eau à température ambiante (20 °C – 90 min) montrent également une diminution significative du taux de bactéries vivantes dans les rameaux après trempage en comparaison du témoin non traité. Ce taux est passé de 100 % à 40 % pour le pommier et de 60 % à 13 % pour le poirier. En dehors de l'effet de l'immersion, cette réduction de viabilité de la bactérie après trempage des rameaux à température ambiante peut être provoquée par le relargage dans l'eau de composés phénoliques synthétisés par la plante empêchant la multiplication des bactéries. En effet, l'eau brunit dès les premières minutes de trempage et notamment autour des rameaux présentant des points de nécrose caractéristiques des réactions de défense de la plante en présence d'Erwinia amylovora. S'il est difficile de distinguer l'effet de la température et l'effet du trempage lui-même, il semble que le cumul des deux paramètres conduit à une absence de bactéries vivantes dans les rameaux, pour les deux espèces pommier et poirier et à toutes températures.

Impact variable sur les agents pathogènes

Les travaux réalisés sur les agents pathogènes ont permis d'identifier différents seuils d'efficacité selon les espèces (Figure 7), notamment pour le Plum pox virus sur abricotier et prunier, le phytoplasme de l'ECA sur prunier américano-­japonais et le feu bactérien sur pommier et poirier. Ces résultats doivent toutefois être mis en relation avec les taux de reprise et les résultats des essais sur le matériel végétal seul.

Figure 7 : Expérimentation du traitement à l'eau chaude contre l'ECA sur prunier salicina - Pourcentage de plants positifs par PCR au cours des 2e (2021) et 3e (2022) cycles végétatifs après greffage

En effet pour le PPV, il semble que la température d'efficacité du traitement pour l'élimination du virus soit très proche de la température de sensibilité des tissus d'abricotier à la chaleur, ce qui peut expliquer les faibles taux de reprise observés. Les seuils d'élimination de l'ECA sur prunier et du feu bactérien sur pommier et poirier semblent en revanche compatibles avec une bonne reprise des plants après traitement. Concernant l'ECA, la réalisation d'un cycle supplémentaire de végétation après traitement a permis de préciser les couples de température – durée jugés efficaces en prenant en compte la biologie du pathogène. Pour le HLB sur les agrumes, si l'assainissement n'a pas pu être réalisé, un constat similaire à celui fait pour l'ECA est fait concernant les populations de bactérie avec des différences de détection en fonction de l'âge des plants : il faut attendre un temps assez long, entre plusieurs mois et plusieurs années, pour s'assurer du non-développement de la maladie. S'agissant de bactéries endophytes, une latence dans le renouvellement des populations et une fluctuation cyclique des populations peuvent en effet être observées. Les analyses de détection doivent prendre en compte ce délai qui semble nécessaire pour permettre une détection fiable de la bactérie. Dans l'objectif d'éliminer le HLB du matériel multiplié, les futurs essais pourront s'appuyer sur la méthodologie des traitements à la vapeur testée ici ou envisager d'autres méthodes d'assainissement comme le traitement de plants entiers en pots [6].

Adaptation de la méthodologie aux contraintes techniques

Les différentes expérimentations étant conduites sur des sites différents, il est nécessaire de construire un protocole le plus universel possible. Ce protocole, décrit dans l'encadré Le protocole mis en oeuvre en laboratoire et serre a toutefois nécessité des adaptations selon le mode de multiplication choisi (greffage ou bouturage) et l'agent pathogène. Plusieurs situations ou contraintes ont conduit les partenaires à proposer puis évaluer des modalités techniques complémentaires en se basant notamment sur leur expertise et la bibliographie. Cela a été le cas de la mise en place de traitements à la vapeur pour les agrumes comme vu ci-dessus, mais aussi de l'expérimentation d'autres solutions pour l'obtention de résultats comme le forçage ou le bouturage après traitement.

Concernant le forçage, des essais comparatifs aux résultats obtenus sur la sensibilité du matériel végétal sont réalisés en chambre climatique dans le but de faire ressortir les résultats plus rapidement que par le greffage. Plusieurs avantages peuvent être mis en avant par cette méthodologie, notamment le gain de temps et d'espace nécessaire à l'élevage des plants. Cette solution est expérimentée pour le cerisier et le prunier. Les lots de rameaux testés selon différents couples température – durée sont placés en chambre climatique à 25 °C – 60 % d'humidité et le démarrage des bourgeons est ensuite noté pour chaque rameau. Le matériel n'a pas été conservé sur une longue durée, l'objectif étant ici de visualiser les effets du traitement sur la viabilité des bourgeons et des tissus végétaux.

La synthèse des résultats concernant trois cultivars de prunier, repris dans la figure 8, permet de comparer les taux de reprises observés à la suite du forçage avec ceux obtenus par greffage pour les mêmes cultivars. Même si des disparités sont observées avec des écarts pouvant aller jusqu'à 20 %, les résultats des reprises sont globalement impactés à partir de 45 °C – 180 min d'immersion. À cette température et même sur une courte durée de trempage, les taux de survie et de reprise des bourgeons sont assez faibles (moins de 40 %). Les bains à 40 °C ont une incidence faible sur la survie des bourgeons avec des résultats similaires aux rameaux témoins et à 55 °C aucun bourgeon ne survit.

Figure 8 : Expérimentation pour le feu bactérien - pourcentage de rameaux présentant des bactéries Erwinia amylovora vivantes pour chaque couple testé et le témoin non traité

L'obtention de résultats comparables concernant l'impact de la température entre greffage/forçage permet d'envisager cette méthode comme alternative afin de cribler plus rapidement les couples température – durée pouvant être intéressants. Des résultats similaires sont obtenus par bouturage des rameaux après traitements en les plaçant dans des conteneurs avec du terreau humide. Les résultats obtenus permettent d'envisager l'utilisation de ce type de technique à l'avenir pour d'autres travaux expérimentaux visant l'impact de la chaleur.

D'autres essais ont permis d'estimer l'impact du traitement à l'eau chaude sur différents types de matériels fruitiers, correspondant aux matériaux commercialisés et implantés sur le territoire, à commencer par les porte-greffe et les scions fruitiers. À titre exploratoire, le trempage de jeunes plantules de porte-greffe de Cadaman® Avimag (Prunus davidiana x Prunus persica) et de jeunes semis de pommier est testé pour des températures de 45 °C à 55 °C et des durées de 15 à 90 min. Le traitement s'est avéré trop impactant pour les jeunes Cadaman® Avimag sans aucune reprise des plants, certainement en raison de leur calibre trop fin. En revanche, les résultats sur les jeunes plants racinés de porte-greffe de pommier ont permis d'obtenir des reprises limitées à la zone de dix centimètres au-dessus du collet et à la partie racinaire. Ces résultats montrent une sensibilité plus forte aux températures de ce type de matériel végétal juvénile au calibre réduit. En effet, un taux de reprise très faible après traitement est observé pour les couples 45 °C – 90 min et 50 °C –15 min alors que les rameaux aoûtés de la même espèce pommier semblent mieux supporter ces couples.

Quelles perspectives ?

L'ensemble des résultats démontre la faisabilité expérimentale du trempage dans l'eau chaude pour lutter contre divers agents pathogènes affectant différentes espèces fruitières. Plusieurs limites sont identifiées et sont principalement liées à la diversité des espèces végétales et des sites d'expérimentations ainsi qu'au faible nombre de répétitions réalisées. Cette dernière contrainte a été choisie dès la construction du projet afin d'expérimenter le traitement à l'eau chaude sur une gamme large de couples hôte – agent pathogène. Il conviendra de reproduire les essais réalisés avec des séries de greffages plus conséquentes en nombre et en durée d'observation pour confirmer les résultats obtenus. L'intérêt grandissant des thématiques de traitement à l'eau chaude sur le territoire et à l'international nécessite de bien caractériser leur potentiel et d'évaluer leur mise en oeuvre technique.

L'intérêt réside principalement dans la mise en place de stratégies de protection complémentaires à celles déjà en place contre divers organismes pathogènes et bioagresseurs émergents ou ré-émergents. D'après les résultats obtenus, il est probable qu'il faudra adapter les traitements à l'eau chaude en fonction de l'agent pathogène et de l'espèce voire des variétés pour les espèces particulièrement sensibles. Par exemple, aucun protocole commun ou universel qui permet à la fois l'élimination du phytoplasme de l'ECA et du virus de la Sharka sur prunier n'a été identifié. Les résultats obtenus pourraient être mis en application rapidement par des structures réalisant un faible nombre de greffes comme les stations de recherche et expérimentation, les conservatoires génétiques ou les installations de quarantaine végétale dans l'objectif de faciliter les introductions de matériels sensibles tout en réduisant les risques. Mais pour limiter l'expansion sur le territoire et l'impact dans les filières de multiplication et de production des différents pathogènes, la technique du traitement à l'eau chaude doit être adoptée plus largement au sein des filières professionnelles.

Des applications concrètes sont attendues en raison des enjeux sanitaires croissants sur le matériel végétal multiplié et du fait des évolutions réglementaires comme la mise en place des autocontrôles. À ce jour, seule la filière viticole dispose d'un protocole appliqué en pépinières, pour un seul pathogène, le phytoplasme de la Flavescence dorée. Comme cela a pu être mis en évidence sur la vigne ([7] et [8]), il sera nécessaire de répondre à plusieurs questionnements technico-économiques avant d'envisager une mise en oeuvre à grande échelle du côté des arbres fruitiers. Dans cet objectif, l'encadré additionnel et disponible dans la version en ligne de l'article, Axes futurs de travail reprend des axes de travail identifiés, comme l'évaluation de l'impact du traitement à l'eau chaude sur les plants fruitiers et leur reprise, et permet d'envisager un canevas de travail pour compléter les expérimentations.

Le protocole mis en oeuvre en laboratoire et serre

Les partenaires du projet conduisent les expérimentations sur différents sites et ont élaboré le protocole le plus universel possible :

  • Traitements réalisés à partir de rameaux fruitiers aoûtés, prélevés entre août et octobre ;
  • Traitement en bain thermostaté type laboratoire ;
  • 1 à 2 rameaux par modalité de traitement (avec au minimum 10 yeux à greffer) ;
  • Application d'un temps d'acclimatation avant et après traitement (24 h à température ambiante) ;
  • Greffage ou bouturage après traitement, selon l'espèce végétale ;
  • Évaluation du taux de reprise au greffage/bouturage par l'observation de repousses de yeux/feuilles un à trois mois après reprise de végétation ;
  • Suivi cultural en végétation après reprise de la végétation et observations de l'apparition de symptômes pendant un à deux cycles végétatifs ;
  • Prélèvement de matériel végétal pour confirmation de l'assainissement par la réalisation d'analyses spécifiques de l'agent pathogène, test de toutes les modalités, selon l'agent pathogène sur matériel symptomatique ou non.

Le protocole mis en oeuvre en laboratoire et serre (2/2)

Le protocole mis en oeuvre en laboratoire et serre (1/2)

Taux de reprise au greffage de différentes espèces fruitières après trempage à l'eau chaude

Taux de reprise au greffage de différentes espèces fruitières après trempage à l'eau chaude


Définitions

Acclimatation / réacclimatation : Temps d'adaptation physiologique du matériel végétal placé à température ambiante

Forçage : Placement du matériel végétal en conditions climatiques permettant de hâter le démarrage des bourgeons

Taux de reprise : Pourcentage d'yeux greffés qui démarrent en végétation

Axes futurs de travail

  • Cibler différents agents pathogènes ou ravageurs posant un risque au niveau épidémiologique (par exemple des organismes de quarantaine ou épidémiques présents sur le territoire).
  • Évaluer la sensibilité du matériel fruitier à la chaleur en prenant en compte la diversité génétique intra-espèce et la gamme commerciale.
  • Adapter l'expérimentation à différents types de matériel fruitier. Pour les rameaux à greffons, la qualité du matériel végétal (vigueur, diamètre, taille des bourgeons, degré d'aoûtement) impacte directement les résultats. D'autres types de matériel fruitier sont à expérimenter comme les jeunes plantules de porte-greffe, les plants greffés, etc. Les essais réalisés ici ont permis d'obtenir des résultats sur jeunes porte-greffe de Prunus avec un faible impact de la chaleur sur la partie racinaire.
  • Déterminer les contraintes techniques liées au traitement à l'eau chaude comme l'impact sur les reprises au greffage, l'élevage des porte-greffe, la diversité de qualité des greffons.
  • Prévoir un nombre de répétitions suffisant et obtenir des résultats reproductibles.
  • Prendre en compte la physiologie et la biologie des pathogènes pour s'assurer de la bonne efficacité du traitement. Par exemple, en allongeant le nombre de cycles végétatifs après traitement pour les bactéries ou les phytoplasmes.
  • Intégrer aux expérimentations des techniques d'évaluation des effets du traitement pour raccourcir la sélection des modalités intéressantes (forçage, bouturage).
  • Tester différentes méthodes de désinfection notamment en alternative aux traitements par immersion comme le traitement par vapeur.
  • Composer un plan expérimental visant à éliminer plusieurs pathogènes de manière conjointe par le traitement à l'eau chaude. Si l'intérêt des traitements paraît indéniable dans l'objectif de limiter les transferts d'organismes de quarantaine, l'élimination simultanée d'organismes moins dangereux mais plus répandus et parfois difficiles à détecter en pépinière comme certains organismes réglementés non de quarantaine (ORNQ) serait un atout non négligeable.
  • Associer les opérateurs professionnels pour évaluer la faisabilité de la transposition au champ. Cette étape sera indispensable à la fois pour la validation des différents couples température-durée et la confrontation de ces résultats aux contraintes techniques du terrain, mais aussi pour permettre l'appropriation et la diffusion de ces techniques d'assainissement à grande échelle. Dès la construction du projet ThermoFruit, le syndicat des pépiniéristes CEP a été associé aux réflexions et a participé aux différentes réunions du comité de pilotage depuis 2019. Des essais au champ peuvent ainsi être envisagés sur la base des résultats obtenus.
  • Inclure une étape de validation sur des équipements de dimension industrielle. Ces équipements existent et sont déjà utilisés pour les traitements TEC en place pour la filière viticole. Il sera donc utile de valider les couples TEC et la faisabilité technique du traitement des fruitiers (quels volumes, calendrier de traitements, etc.) sur ces équipements.
  • Évaluer les coûts économiques et environnementaux de la mise en oeuvre de traitements à l'eau chaude.

Sur la base de ces éléments, les partenaires du projet ont lancé plusieurs travaux et expérimentations, notamment avec d'autres équipes de recherche et instituts. C'est le cas du projet « ViATEC » déposé à l'AAP CASDAR Connaissances France Agrimer en février 2023 avec l'Institut Français de la Vigne et du Vin (IFV), le CTIFL, le CEP, INRAE et plusieurs partenaires professionnels. Ce projet, en attente de validation, vise à mesurer l'impact du traitement à l'eau chaude contre la maladie du Bois Noir sur la vigne et contre le Pear Decline sur les poiriers. En effet les dynamiques épidémiques de ces deux maladies provoquées par des phytoplasmes sont similaires avec une recrudescence des symptômes depuis quelques années et de fortes attentes en termes d'outil de protection pour les filières de multiplication. Les résultats de sensibilité du poirier obtenus avec ThermoFruit, sont une base pour évaluer l'efficacité du traitement à l'eau chaude sur du matériel infecté Pear Decline en appliquant le protocole en conditions de pépinière et avec l'utilisation de stations de traitements industrielles.

Remerciements

Les auteurs remercient le CEP, le CTPS et le CIRAD, les membres du comité de pilotage pour leurs contributions et soutien à toutes les étapes du projet.

Les données clés à retenir

Traitement à l'eau chaude de matériel fruitier infecté par des virus, bactéries ou phytoplasmes - Résultats du projet ThermoFruit

Le projet ThermoFruit a évalué la technique du traitement à l'eau chaude pour l'assainissement d'agents pathogènes affectant les espèces fruitières. L'évaluation de cette technique sur des virus, phytoplasmes et bactéries a permis d'identifier des couples de température et de durée efficaces pour l'élimination du Plum pox virus sur prunier et abricotier, de l'enroulement chlorotique de l'abricotier sur prunier et du feu bactérien sur pommier et poirier. Les seuils de sensibilité à la chaleur des espèces fruitières montrent des disparités notamment sur le taux de reprise du matériel greffé après traitement. Les résultats permettent d'envisager la mise en application de la technique à plus large échelle et sécuriser ainsi la multiplication, l'entrée sur le territoire ou le maintien de ressources génétiques.

Key points

Hot water treatment of fruit tree planting material infected by viruses, bacteria or phytoplasmas - Results of the ThermoFruit project

The ThermoFruit project evaluated the use of hot water treatment to eradicate pathogens affecting fruit species. The evaluation of this technique on viruses, phytoplasmas and bacteria enabled the identification of effective temperature and time combinations for the elimination of Plum pox virus on plums and apricots, apricot chlorotic leafroll on plums and fire blight on apples and pears. The heat sensitivity thresholds for fruit species show disparities, particularly in the survival rate of grafted material after treatment. The results suggest that this technique could be applied on a larger scale, thereby securing the multiplication, entry into the country and maintenance of genetic resources.

Bibliographie / Sitographie

[1] Brans Y., 2019. Traitement à l'eau chaude pour l'assainissement du matériel fruitier - Le projet ThermoFruit évalue la faisabilité. Infos-CTIFL N° 357 pp28-33.

[2] EPPO, 2012. Hot water treatment of grapevine to control Grapevine flavescence dorée phytoplasma. EPPO Bulletin, 42 : 490-492. doi :

[3] EPPO, 2020. EPPO Standard PM 7/62 (3) - Candidatus Phytoplasma mali, Ca. P. pyri and Ca. P. prunorum. EPPO Bulletin, 50 (1), 69-85.

[4] ANSES, 2019. AVIS et RAPPORT de l'Anses relatif à une analyse de risque phytosanitaire pour la maladie du huanglongbing pour l'Union européenne (PDF)

[5] Pirc, M., Ravnikar, M., Tomlinson, J., & Dreo, T., 2009. Improved fireblight diagnostics using quantitative real-time PCR detection of Erwinia amylovora chromosomal DNA. Plant Pathology, 58(5), 872-881.

[6] Choi, C. W., Hwang, R. Y., Powell, C. A., & Hyun, J. W., 2020. Elimination of Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), the bacterium associated with citrus Huanglongbing in citrus trees by heat treatment. European Journal of Horticultural Science, 85(6), 477-481.

[7] Remolif E., Zufferey V., Dubuis P.H., Voinesco F., Fendeleur O., Gindro K., 2014. Traitement des bois à l'eau chaude contre la flavescence dorée : effet sur l'anatomie et l'intégrité des tissus conducteurs. Revue Suisse de viticulture, Arboricul¬ture, Horticulture, vol 46 (5), 302-308.

[8] Stessels C, Tassart-Subirats V, Bloy P., 2012. Impact du traitement à l'eau chaude sur la reprise des plants de vigne. https://www.vignevin.com/wp-content/uploads/2023/01/ArticleTEC_Essais_multisites.pdf